Human Small Cell Lung Cancer Organoid Kit

人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基套裝

1、 產(chǎn)品描述

?；锶诵〖毎伟╊惼鞴倥囵B(yǎng)基套裝（Human Small Cell Lung Cancer Organoid Kit）是一種化學(xué)定義的細胞培養(yǎng)基，用于建立和維持小細胞肺癌類器官。病人來源的腫瘤類器官概括了原始腫瘤的基因組和病理特征，因此在醫(yī)學(xué)研究和精確醫(yī)學(xué)中具有巨大的前景。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術(shù)配制人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基。以下是配制10mL培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1、   冰上解凍人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)因子B(50x)和人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)因子C(250x)。

注意：解凍后，建議將人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)因子B(50x)和人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)因子C(250x)分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融

2、   將200uL人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)因子B(50x)，40uL人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)因子C(250x)加至9.76mL人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分混合，配制成10mL人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基。

注意：配制后的人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基可在2-8°C儲存，建議在兩周內(nèi)使用。人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細菌及真菌抗生素。

5、 病人來源的小細胞肺癌類器官的原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

a)     原代小細胞肺癌類器官的建立

1、   用離心管將原發(fā)性人小細胞肺癌組織碎片收集在冰冷的原發(fā)組織儲存溶液中。將組織樣品保持在4℃，直到分離開始。

2、   評估獲得的組織碎片是否由上皮組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用刀或和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續(xù)下一步。

3、   用人小細胞肺癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或DPBS沖洗組織兩次。

4、   使用刀或?qū)⒔M織切碎成1-3mm³的小碎片，置于細胞培養(yǎng)皿中。

5、   在37℃下用10mL腫瘤組織消化溶液在15mL離心管中消化組織片段，消化時間可變，從30分鐘到1.5小時不等。仔細監(jiān)測消化過程，可適當(dāng)吹打取上清觀察消化程度。當(dāng)大多數(shù)組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時，消化過程即完成。

6、   將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，并使用100μm細胞過濾器過濾。

7、   收集并在4°C下以250g離心過濾的細胞3分鐘。在可見的紅色沉淀的情況下，吸入上清液，并使用2mL紅細胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細胞1分鐘，并在4°C下以250g離心3分鐘。

8、   吸出上清液并將沉淀重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在4°C下以250g離心3分鐘，再次重復(fù)此步驟。

9、   吸出上清液并將沉淀重懸于基質(zhì)膠中?；|(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。使用的基質(zhì)膠的量取決于顆粒的大小。大約10，000個細胞應(yīng)接種在25μL基質(zhì)膠中。

10、 不要過度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。將含有類器官的基質(zhì)膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板的底部，每個液滴圍繞孔中心約30μL。

注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進行種板，因為基質(zhì)膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。不要讓基質(zhì)顆粒接觸管壁。

11、 將培養(yǎng)板放入37°C和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)凝膠固化。

12、 準(zhǔn)備所需量的人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基。

13、 一旦基質(zhì)膠滴凝固（15-25分鐘），打開板并小心地向每個孔中加入500μL人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基。注意：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

15、 每隔3-4天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并用新鮮的預(yù)熱的類器官培養(yǎng)基代替它。

16、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，人小細胞肺癌類器官應(yīng)在7-9天內(nèi)建成。

b)      人小細胞肺癌類器官的傳代培養(yǎng)

1、   待類用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過潤洗液潤洗的1.5mL EP管中。

2、   用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3、   250g離心力室溫離心3min。

4、   棄上清，使用類器官消化液或用機械破壞。對于使用類器官消化液的細胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液，移液器反復(fù)上下吹打并置于37°C孵育，直至類器官解離。使用帶濾芯槍頭每2分鐘反復(fù)上下吹吸8次，以幫助類器官解離。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。如發(fā)生機械故障，在1.5mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸類器官懸液。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復(fù)上下30次，這將有助于消化。

注意:不要在類器官解離液中解離超過7分鐘，因為這可能會導(dǎo)致較差的類器官的生長甚至破壞。根據(jù)經(jīng)驗，如果是小塊細胞的混合物，可以觀察到由10-50個細胞組成的細胞團，消化就完成了。

5、   消化完成后，用1mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行一次沖洗，然后室溫下250g離心3分鐘。

6、   棄上清，用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30s以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7、   將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點入24孔板底部正，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30uL左右。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8、   將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待基質(zhì)膠凝固。

9、   配制人小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基。

10、 待基質(zhì)膠凝固后，加入已配制好的小細胞肺癌類器官培養(yǎng)基，48孔板每孔加入250uL培養(yǎng)基。

11、 將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進一步的實驗。

V2.0版

更新時間：2025/6/21